藻類表現型研究の包括的ソリューション

藻類は藍藻門、眼虫藻門、金藻門、甲藻門、緑藻門、褐藻門、紅藻門など一連の水生生物の総称である。その形態は種類が多く、小からミクロン級の単細胞微細藻、長さが数メートルから数十メートルの大型褐藻まである。藻類は水体の中で最も重要な一次生産者として、生態系全体、ひいては地球圏の安定に極めて重要な役割を果たしている。ライン藻、藍藻などのモード藻類は機能遺伝子、生物進化、光合成などの研究に優れた材料を提供した。同時に、多くの経済藻類も食品、医薬、エネルギーなどの業界で重要な役割を果たしている。水華、赤潮などの有害な生態現象も藻類によるものだ。そのため、藻類の研究はずっと生物学と生態学の中で非常に重要なホットスポットである

現在、生命科学研究分野で最も注目されている研究の焦点の一つである表現型グループ学の研究は、主に植物/作物分野に集中している。藻類分野では、表現型グループ学の研究が始まったばかりだが、発展速度は極めて速い。藻類表現型グループ学の一方は藻類ゲノム学の補充と検証であり、ゲノムと環境要素の植物表現型に対する複雑な作用と中間の変化過程を解釈する、一方、経済藻類の抗逆生理研究と遺伝育種に用いることができ、藻類の表現型を全面的に分析し、より優れた経済藻種を獲得することができる、水華、赤潮の発生メカニズムの研究にも用いることができる。

藻類表現型グループ学は藻類の表現型特徴を全面的に分析する必要があり、特に光合成生理、形態、色、色素組成と分布、異なる色素の光合成貢献、ストレス生理などの方面の測定と分析は、藻類表現型のデジタル化、生理生態と機能の可視化を行う。これには、藻類の表現型に特化した技術ソリューションが必要です。

方案に挙げられた計器は具体的な研究ニーズに応じて柔軟に組み合わせることができ、しかもすべての計器の国際的認可度は極めて高く、国内外の科学者はこれらの計器を用いて大量の科学研究論文を発表した。以下に、一部のシステム方案の応用例を紹介する。

1. 藍藻光合成のメカニズムの深い研究

中国科学院水生生物所の王強研究員は亜硝酸塩ストレスによる藍藻へのSynechocystissp.PCC 6803光システムIIのストレス機構、使用AquaPen手持ち式藻類蛍光測定器、FL3500クロロフィル蛍光計（FL 6000前モデル）とTLクロロフィル熱ルミネセンスシステムを測定分析し、それぞれFv/Fm最大光化学効率、OJIP高速蛍光動力学曲線、QA-再酸化動力学曲線、S-state測定とTL熱ルミネセンス曲線を測定分析した。研究の結果、亜硝酸塩ストレスの最初の影響を証明したSynechocystissp.PCC 6803光システムII受容体側（Zhan X，2017）

左：実験サンプル、次のいずれかの操作を行います。Fv/Fm;右：OJIP高速蛍光動力学曲線

左：QA−再酸化動力学曲線、中：S-state測定：右：TL放熱曲線

左：AquaPen手持ち式藻類蛍光測定器、中：FL 3500双変調クロロフィル蛍光計、右：TLクロロフィル放熱システム

参考文献：Zhang X, Ma F, Zhu X, Zhu J, Rong J, Zhan J, Chen H, He C, Wang Q. 2017. The acceptor side of photosystem II is the initial target of nitrite stress in Synechocystis sp. strain PCC 6803. Appl Environ Microbiol 83:e02952-16

2. ラインクロレラ分子事件の多群学的解析

ライン藻Chlamydomonas reinhardtiiの新陳代謝は環境変化に良い適応性がある。カリフォルニア大学のDaniela Strenkertは、この日のライン藻の転写群とタンパク質群の変化を研究する光暗周期のシミュレーションを試みた。この研究では、まず動的に変化する培養環境を正確にシミュレーションすることが求められ、同時に関連培養環境及び藻類密度、生理などを監視する必要がある。これにより、後続のグループ解析にできるだけ正確なサンプルを提供することができます。現在この要求を達成できる藻類培養モニタリング機器はFMT 150藻類培養とオンラインモニタリングシステムのみである。その培養条件は以下のように設定されている：

n複数台のFMT 150の同時培養

n200 μE赤/青、12時間昼夜交代、日の入りシミュレーション

n日中28℃、夜18℃

n通気速度0.2 L/min

nリアルタイムモニタリング温度、OD 680、およびpH

定濁予備培養5日間、OD 680〜0.4制御

左：A.FMT 150模式図、B-D.培養中のリアルタイムモニタリング温度、OD 680とpH、右:異なる光強度における最大光化学効率Fv/Fmの動的変化

葉緑素蛍光分析は光合成生理と表現型グループ学の研究に不可欠な部分である。そこで本研究ではFluorCam閉鎖式蛍光イメージングシステムは異なる光強度におけるライン藻類の最大光化学効率Fv/Fmの動的変化を測定し、光強度がライン藻類に与える影響を反映し、蛋白質群、転写群データと相関分析を行う

左:FMT150藻類培養とオンラインモニタリングシステム、右：FluorCamクローズド葉緑素蛍光イメージングシステム

参考文献：Strenkert D,et al.2019, Multiomics resolution of molecular events during a day in the life ofChlamydomonas. PNAS 116 (6): 2374-2383

3. 南極の藻類と地衣の気候応答を監視する

2006年、チェコは南極James Ross島にJohann Gregor Mendel駅を建設した。同ステーションに駐留するチェコのマサリク大学の科学研究者は2007年から、南極の温度上昇に対する現地の藻類と地衣の応答を研究し、南極の生態系に対する温室効果効果の影響を評価している。当時、彼らは極地適応能力を強化したAquaPen/FruorPenシリーズの手持ち式葉緑素蛍光測定器を使用して藻類と地衣の光合成生理と成長状態を検出した。AquaPen/FruorPenは手動で操作することもできるし、クロロフィル蛍光を監視する無人の機能も備えており、南極の過酷な環境下で良好に表現されている。

近年、科学研究者はモニタリング実験用に設計されたMonitoring Pen葉緑素蛍光自動モニタを使用し始めた。Monitoring Penは、陸上エンハンスと水中エンハンスの2つのバージョンを備えた理想的な状況で自動的に2年間連続して動作します。。

左：Johann Gregor Mendelステーション2007-2009年に使用されたAquaPen/FruorPen、右：近年使用され始めたMonitoring Pen

左：Monitoring Pen陸上強化版、右：Monitoring Pen水中強化版

参考文献：Bartλk M，et al.2009, Long-term study on vegetation responses to manipulated warming using open top chambers installed in three contrasting Antarctic habitats. Structure and function of antarctic terrestrial ecosystems, Masaryk University

4. ラインクロレラの高光ストレス応答の分子機構

すべての光合成生物は、光合成酸化ストレスを回避するために過剰な光照射に対応しなければならない。植物と緑藻にとって、ハイライトの最速応答機構は光システムIIの非光化学クエンチ（NPQ）である。このプロセスにより、光システムIIは、過剰なエネルギーを熱の形で安全に散逸することができる。PsbSタンパク質はこの過程で重要なセンサーである。

PsbSタンパク質がライン藻にあることを確認するためにChlamydomonas reinhardtiiのNPQと光保護における役割、アイコス・マルセイユ大学Tibiletti Tなどは藻類や擬南マスタードを発現できるように培養したpsbS遺伝子の葉緑体トランスジェニック株。FluorCamオープン葉緑素蛍光イメージングシステムによるNPQイメージング分析の結果、2つのPsbSタンパク質がライン藻野生型とnpq4突然変異株のNPQであるが、Fv/Fm測定では明確な光保護活性は観察されなかった。

左：NPQイメージング図、中：光暗周期中のNPQ動的変化、右：Fv/Fmデータ解析

同時に、2つの白色光LED光源板を使用して持続的なハイライトストレス（1200µmol m-2 s-1）をシミュレーションした。Fytoled光源システムは波動光照射条件（3分1200µmol m-2 s-1＋3分45µmol m-2 s-1）をシミュレーションして成長率実験を行い、FluorCamシステム青色LED光源板を用いた波動光照射条件（3分間1200µmol m-2 s-1＋3分間20µmol m-2 s-1）をシミュレーションしてFv/Fm分析を行った。これらのLED光源プレートは、実際には同じ技術源、PSI社のSL 3500 LED光源プレートから来ています。このLED光源の開発は、FluorCamシステムのクロロフィル蛍光イメージング測定に高強度、高平均一度、高純度の光照射を提供するとともに、精密からマイクロ秒級までの自動制御機能を搭載するためである。このLED光源をベースに開発された培養システムは、他の培養システムでは達成できない高性能を自然に備えている。欧米の多くの研究者は、この光源を使って独自に設計した培養システムを構築している。例えば、2012年にNatureが発表した「Recovery rates reflect distance to a tipping point in a living system」という文では、著者はSL 3500光源を用いて独自に設計した藻類培養システムを構築した。

左：FluorCamオープン葉緑素蛍光イメージングシステム、中：SL 3500 LED光源板、右：AlgaeTron/FytoScope藻類/植物培養箱

参考文献：Tibiletti T,et al. 2016. Chlamydomonas reinhardtiiPsbS protein is functional and accumulates rapidly and transiently under high light. Plant Physiology, 171(4): 2717-2730